目前已通过中国合格评定国家认可委员会(认可委,CNAS,下同)的 ISO15189 认可的医学实验室已达 200 余家。在 ISO15189 评审中,对检测系统的溯源性和性能评价是必查内容之一。在国内,检测系统有其独特之处,那就是生化项目的非配套系统-国产试剂。
针对国产生化试剂如何获取 ISO1518 的青睐这个问题,来谈一谈国人如何做临床生化非配套检测系统的确认实验。
检测系统是用于检测或评估特定物质存在与否,或对血液、体液中的物质进行定量的一组装置。检测系统包括操作说明和所有的仪器、设备、试剂及(或)获得检测结果所需的物品。
简而言之,完成标本检验必需的仪器、试剂、校准品和检测程序等的组合为检测系统。(须注意的,这里的检测系统指的是每个检验项目的。因此,仪器上能同时做多少检验项目,就有每个项目的检测系统。)
目前国际上的知名厂商提供完整的检测系统系列,系统的性能得到了诸如 FDA 的确认,有完整的溯源程序,称之为配套系统。而非配套系统则是由实验室按照自己的意愿,选择需要的仪器、试剂、操作程序(一般没有校准品,有标准液)等组合的检测系统。国内鉴于法规和技术的不完备,仪器和试剂注册时无需提供完整的溯源性材料,且分别注册,导致国产试剂遍地开花,号称可以用到国内外各型号仪器上,造成的检测系统五花八门。
面对国内大量的实验室自行建立的检测系统,应该怎样寻找检测结果可靠性和溯源性,是一个极大的现实问题。
依据 CNASISO15189 认可文件 CL02:2012《医学实验室质量和能力认可准则》5.5.1.3 和 CL38《医学实验室质量和能力认可准则在临床化学领域的应用说明》5.5.1.3 的要求:「5.5.1.3 如果使用内部程序,如自建检测系统,应有程序评估并确认正确度、精密度、可报告范围、生物参考区间等分析性能符合预期用途。」
实验室需对非配套系统进行确认实验,以保证检验结果的准确性,满足 ISO15189 认可要求。因非配套系统确认实验比配套系统的验证试验较复杂,实验方案多采用国内外公认的美国临床实验室标准化委员会(CLSI)发布的 EP 文件相关内容,由于 CLSI 文件有版权,国内一般用户不易获取,导致临床实验室对确认实验不是太熟悉,为了满足 ISO15189 质量体系要求,特此谈谈我对确认实验方案的了解,以飨读者,不当之处,欢迎拍砖。
特别注意的是,按照国际惯例(CAP 和 CLIS 的做法)以及对临床工作的重要性原则,实验顺序分别是精密度、正确度、可报告范围和参考区间的确认。
精密度确认
1. 参考依据:CLISEP5-A2 文件
2. 标本要求:实验需要高低两个浓度的标本,标本尽量选择浓度接近医学决定水平的,如无法查询到临床决定水平,标本选择一个在参考区间内的,一个高值的。附临床决定水平查询网站:https://www.westgard.com/decision.htm
3. 检测频次:每天检测两个批次,上下午各一次,最少间隔 2 h。每批次重复检测 2 次;共检测 20 天。
4. 结果处理:这样每个浓度的标本有 80 个数据,两个浓度共计 160 个数据。参考 CLSIEP5-A2 文件或《应用 CLSI EP5A2 文件评价生化检测系统的精密度性能》的相关公式计算批内、批间、室内、天间精密度,判断标准参考卫计委标准《WST 403-2012 临床生物化学检验常规项目分析质量指标》(卫计委网站可下载),将评价的不精密度与行业标准中的允许不精密度比较,判断方法的可接受性。
对于部分检测项目,可能没有行业标准,可用方法决定图判断。
正确度确认
1. 目前行业公认的正确度确认实验有两种方式:检测有证参考物质和比对试验。大家都了解,有证物质非常昂贵且不易获取,所以我建议采用后者(与配套系统比对)进行正确度确认。
2. 依据:CLISEP-9A3[6] 文件(目前很难获取正版文件,只能参考文献)或 EP9-A2。
3. 标本要求:尽量使用患者标本,浓度尽可能均匀分布在测量范围内,排除影响检测标本(如溶血、黄疸、脂血、浑浊)。如需使用处理过的标本 (如添加纯的高浓度物质),应小于比对标本总数的 20%。
4. 数量和次数:厂家用于建立或确认声明标准,标本数量应 ≥ 100 份;增加样本数将提高统计估计值的可信度。如重复测量,应计算其平均值。临床实验室在比对分析时,至少需 40 份样本,每份重复检测 2 次。
5. 测定顺序:参比方法和待评方法需随机顺序测定每批标本。
6. 参考系统:FDA 确认的配套系统(例:西门子 2400+西门子试剂+西门子校准品)。注:一个牌子的仪器不一定配套统一牌子的试剂和校准品,只要建立的系统经过 FDA 确认,能提供溯源性文件即可(目前很多日本的仪器厂家在本土生产仪器、在欧洲生产试剂,但配套在仪器上使用,具备国际溯源性认证)。
7. 比对系统:实验室自行建立的非配套系统。
8. 数据分析和作图请参考 CLISEP-9A3 文件或《CLSI+EP9-A3 在临床生化方法学比对中的应用》、《新指南 CLSIEP9-A3 在方法学比对及偏移评估中的应用》。由于篇幅问题,在此不再赘述。
可报告范围(包括线性范围和临床可报告范围)
1. 线性范围(也叫测量范围)
(1)实验方案:CLSIEP6-A2[9] 文件表明新方法的可报告范围的建立需采用 7~11 个浓度的样品,最好是较预期测量范围宽 20%~30% 的浓度范围。根据预期不精密度对样品重复检测 2~4 次。临床实验室也可参考卫生行业标准 WS/T408-2012《临床化学设备线性评价指南》,推荐验证实验采用 4~6 个浓度水平,确认实验采用 9~11 个浓度水平,每个样品重复检测 3~4 次。
(2)标本要求:一般选择线性下限和上限浓度附近的 2 个患者新鲜标本,等比例混合制备不同浓度的待测标本。覆盖整个预期测量范围并包括临床有意义的浓度水平。
(3)举例:预计检测 9 个浓度,准备足量高低浓度标本,按 9:0、8:1、7:2、6:3、5:4、4:5、3:6、2:7、1:8、0:9 等比例混合得到 9 份混合血清,分别重复检测 3 次,取均值。根据 WS/T408-2012《临床化学设备线性评价指南》文中相关公式拟合曲线,计算线性范围。
2. 临床可报告范围
(1)目的:仅对于那些临床可报告区间大于分析测量范围的检测项目才需要进行验证(比如血钾的参考范围 2-10 mmol/L,超过 10 mmol/L 已经没有任何意义,这个项目就无需验证)。通常是在线性范围高值的基础上外延至最大稀释度倍数对应的值。
(2)标本来源:含本项目浓度接近线性范围上限的临床新鲜标本。
(3)评价方案:用厂家推荐的稀释液(或以生理盐水或蒸馏水为稀释介质)对超过分析测量范围上限的高值样本进行系列手工稀释,每份稀释样本重复测定 3 次取平均值,与预期值进行比较。
(4)判断标准:计算判断指标 R 值,R = 检测均值/预期值×100%,判断标准:80%<R<120%。
参考区间确认
1. 确认依据:根据 EP28-A3C[11] 或 WS/T402-2012《临床实验室检验项目参考区间的制定》。
2. 标本要求:如果厂家已声明参考区间或采用国家颁布的参考区间,需选择 20 例健康人标本,做验证。如果需要建立参考区间,需要 120 例健康人群的标本。
注意:如果参考区间有性别或年龄分组,每组标本数量需满足上述要求。
3. 卫计委 2012-2015 先后公布了 18 个项目的参考范围,其中含有 CNAS 要求申报的 21 个项目中的钾、钠、氯、钙、磷、尿素、肌酐、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、肌酸激酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、总蛋白、白蛋白等 14 个项目,这 14 个项目的参考范围实验室直接引用,无需建立参考区间,只需验证参考区间即可。
另外 7 个项目葡萄糖、尿酸、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、总胆红素需建立参考区间,标本需来自 120 个健康人,如有分组(比如男女或年龄),每组也需 120 例。
根据《认可准则》5.5.1.3 的要求,非配套系统的确认实验性能指标包括测量正确度、测量准确度、测量精密度(含测量重复性和测量中间精密度)、测量不确定度、分析特异性(含干扰物)、分析灵敏度、检出限和定量限、测量区间、诊断特异性和诊断灵敏度。本文仅仅对生化非配套系统的 4 个最基本性能指标进行了描述,其他性能指标根据检查系统的质量需求分别进行确认实验,比如促甲状腺激素(TSH)需要做分析灵敏度,免疫定性项目例如 ELISA 需要做诊断特异性和诊断灵敏度确认等。
参考文献
1. CNAS-CL02.医学实验室质量和能力认可准则 [S].中国合格评定国家认可委员会,2012.
2. CNAS-CL38.医学实验室质量和能力认可准则在临床化学检验领域的应用说明 [S].中国合格评定国家认可委员会,2012.
3. CLSI.EP5-A2 Evaluation of precision performance of quantative measurement methods;approved guideline. second edition[S].Wayne,PA:CLSI,2004.
4. 温冬梅,张秀明,吴剑杨,等.应用 CLSI EP5-A2 文件评价生化检测系统的精密度性能,[J].检验医学与临床,2010,7(19):2096-2098.
5. WS /T 403-2012. 临床生物化学检验常规项目分析质量指标,[S]. 中华人民共和国卫生部,2012.
6. CLSI.EP9-A3 Measurement procedure comparison and bias estimation using patient samples;approved guideline.Third Edition [S].Wayne,PA:CISI,2013.
7. 徐建华,刘冬冬,戴永辉,等.CLSI EP9-A3 在临床生化方法学比对中的应用,[J].中华检验医学杂志,2015,35(5):346-348.
8. 徐建华,刘冬冬,黄宪章,等. 新指南 CLSI EP9-A3 在方法学比对及偏移评估中的应用,[J].中华医学杂志,2015,95(12):894-897.
9. CLSI.EP6-A2 Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures: a statistical approach; approved guideline. second edition [S].Wayne,PA:CISI,2003.
10. WS /T 408-2012.临床化学设备线性评价指南 [S].中华人民共和国卫生部,2012.
11. CLSI.C28-A3c.Defining,establishing,and verifying reference intervals in the clinical laboratory; approved guideline-third edition[S].Wayne,PA:CLSI,2008.
12. WS /T 402-2012.临床实验室检验项目参考区间的制定 [S].中华人民共和国卫生部,2012.
本文作者:丁香园临床检验医学讨论版版主 guoxux